RNA-IN/RNA-OUT基因线路的创新研究
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2024年10月10日,中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所娄春波课题组与清华大学生命科学学院吴琼课题组合作,在《Nature Communications》上发表了题为“High-resolution and programmable RNA-IN and RNA-OUT genetic circuit in living mammalian cells”的研究论文。该研究通过构建具备感应和响应功能的RNA-IN/RNA-OUT基因线路,实现了对内源RNA调控网络的重构,并具备了活细胞内RNA序列点突变的高感知能力。
随着单细胞技术的快速发展和各类细胞图谱计划的推进,研究者们得以解析细胞类型和状态。然而,RNA作为决定细胞类型和状态的核心介质,其表达的失调或突变可能导致多种病变的发生。现有技术大多止步于RNA的检测,缺乏将RNA变化信号转化为细胞状态调控的能力。虽然最新的RNA传感器如eToehold switch和ADAR switch在RNA浓度感应方面有所突破,但仍存在设计灵活性差和脱靶毒性等局限性。因此,如何在活细胞中精准、高效、可编程地感应和调控RNA的动态变化仍然是生命科学和医药领域的一大挑战。
RNA-IN/RNA-OUT基因线路的构建
为解决上述问题,研究团队提出了一种新的策略,开发了一种高灵敏、可编程、具单核苷酸分辨率的RNA感应及响应基因线路,命名为RNA-IN/RNA-OUT。该线路主要由三个模块组成:上游的RNA识别感知模块(RNA-IN)、下游的内源RNA表达输出模块(RNA-OUT)以及负责信息处理的模块。研究人员通过“识别-激活”的策略构建了可编程的RNA传感器,称为CASP传感器,来感知RNA动态信号。
CASP传感器包括可编程的RNA结合蛋白(DiCas7-11)和效应蛋白,能够通过crRNA引导激活蛋白酶活性,释放锚定在细胞膜的效应蛋白,从而实现转录调控。经过精密设计,研究团队成功将RNA的灵敏感应能力提升至能够检测到低至8个转录本每百万条转录本(TPM)的水平。
单碱基突变的灵敏检测
除了RNA表达异常,基因突变同样是导致多种疾病的重要原因。由于野生型与突变型RNA序列之间往往仅有单个核苷酸的微小差异,传统检测方法难以有效识别。为解决这一挑战,CASP传感器中的关键元件“DiCas7-11”展示了对单碱基突变的较高容忍度。研究团队通过引入辅助突变位点的协同策略,首次将单点突变的感知能力从1.5倍提升至94倍,实现了对单碱基突变的高灵敏检测,尤其在肿瘤关键基因如KRAS、TP53等的检测中,CASP传感器表现出了优异的识别能力。
应用前景与总结
研究团队进一步将CASP传感器与可编程的内源性激活器dSpCas9-VPR连接,形成完整的RNA-IN/RNA-OUT基因线路,实现了对不同表达水平RNA的超灵敏感知与灵活操控。这一线路可用于连接持续表达的RNA以激活孕酮的内源性合成代谢网络,动态监测细胞分化状态变化,以及选择性识别并杀死特征点突变的癌细胞。
综上所述,RNA-IN/RNA-OUT基因线路具备高灵敏度、可编程性和单碱基分辨率的特点。该技术不仅能在活细胞中感应RNA的动态变化,还能直接将信号转换为特定基因的转录调控指令。这为细胞命运的操控提供了革新性的技术支持,并在细胞与基因治疗、细胞重编程以及生物合成等领域展现了广泛的应用前景。
2025-01-19
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